Sam Winchester (Jared Padalecki) nasceu em 2 de maio de 1983, filho de John E. Winchester e Mary Winchester em Lawrence, Kansas. É o filho mais novo do casal, tendo um irmão quatro anos mais velho, Dean Winchester.
Sam é diferente do seu irmão mais velho: é sensível, racional, mais inocente,bonito e aparentemente mais preocupado em ter uma "vida normal" do que seu irmão. Apesar disso, fica claro que ele faria qualquer coisa por Dean. Ele também revolta-se contra a tentativa de seu pai de transformá-lo em um caçador e matricula-se na Universidade de Stanford.
Quando Dean vai ter com Sam e pede-lhe ajuda no primeiro episódio, a namorada de Sam, Jessica, é apresentada aos espectadores. É evidente que Sam era de alguma forma popular, apesar de ninguém saber o que sua família realmente faz. O apelido "Sammy" foi dado a ele por seu pai, embora ninguém para além de Dean esteja permitido chamá-lo assim. Sam indica isso no episódio da 1ª temporada "A Familia Bender", quando um homem o chama de Sammy, ele furiosamente responde que o seu nome é Sam. O caçador Gordon Walker também o chama de Sammy no episódio "Sede de Sangue", sendo que Sam, irritado, explica que Dean é o único que pode chamá-lo assim.
Devido ao seu caráter gentil e sua vontade de ter uma vida normal, Sam é mais cuidadoso com as mulheres e por isso tem mais interesse em romances do que Dean, como por exemplo, os que teve com Jessica, Sarah Blake e Madison.
Outro fato curioso sobre Sam, é que o rapaz é uma das muitas pessoas que sofrem da famosa Coulrofobia, ou seja, Sam tem medo de palhaços.
Quando Sam tinha apenas seis meses de idade (Novembro 02, 1983), sua mãe foi assassinada enquanto estava próxima ao seu berço pelo demónio Azazel. Ele foi salvo por seu irmão mais velho Dean, enquanto seu pai tentava salvar Mary, que estava presa ao teto do quarto e sendo consumida pelo fogo, que acabou se espalhando por toda a casa.
Vinte e dois anos depois,acreditava-se que Azazel também matou sua namorada Jessica, mas descobre-se na quinta temporada que "Jessy" foi morta por Brady (Demónio que perseguia Sammy desde a infância) com o objetivo de Sam reconhecer seu proprio destino. Agora os irmão winchester embarcam em várias jornadas para tentar achar seu pai e o demónio que causou a morte de Mary e Jessy. Enquanto John, está desaparecido, ele ocasionalmente entra em contato com os seus filhos para lhes dar tarefas. Os irmãos lidam com criaturas míticas, lendas urbanas e folclore, como o wendigo, a mulher de branco e Bloody Mary. Nesta época, Sam começa a apresentar sinais deprecognição e por uma vez demonstra ter poderes de telecinese.
